Anterior gradient protein 2 homolog (AGR2），前梯度蛋白 2，是一種分泌或定 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白，主要表達于氣管、肺、胃、小腸、結腸和前列腺等組織中， 其作用主要與粘蛋白 (Mucin 2）的合成與分泌相關，因此該蛋白在腫瘤相關研究 中受到較大重視。Cloud-Clone Corp. 公司針對該蛋白研制出了蛋白、抗體和 ELISA 檢測試劑盒等一系列相關檢測工具，供相關研究者使用。

由于 AGR2 蛋白是一個只有 175 個氨基酸的蛋白，通過抗原表位及功能結構 域的分析，我們選取了去掉信號肽的全長蛋白序列（Arg21~Leu175）作為免疫原 的序列，這樣不僅在免疫原的角度使該蛋白包含 AGR2 的所有抗原表位，同時選 取全長序列也可以方便對該蛋白研究有需求的研究者進行蛋白水平的研究。依據(jù) uniport 中 O95994 所對應的蛋白及核酸序列設計引物如下，引物分別含有一個 EcoRI 的酶切位點和一個 XhoI 的酶切位點，用于后期重組載體的構建：

[ PRIMER INFORMATION ]

Upstream Primer: CGGAATTCAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAG

Downstream Primer: CCGCTCGAGTTACAATTCAGTCTTCAGCAACTTG

完成引物設計后，通過模板對該蛋白的基因進行了克隆，PCR 獲得一個 片段大小約為 450bp 的 DNA 片段。測序正確后，采用傳統(tǒng)的雙酶切法與 Cloud-Clone Corp.自主構建的大腸桿菌表達載體 pUSCNK-1 進行連接，并用 于后期的蛋白表達，測序結果如圖 1 所示。

圖1 pUSCNK-1 AGR2 測序結果

獲得測序結果后，將其與 NCBI 序列比對發(fā)現(xiàn)，其與人 AGR2 的相似性為 100%，從而證明了擴增序列的正確性，序列比對結果如圖 2。

圖 2 核酸序列比對結果

此后，將表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌，并經(jīng) IPTG 誘導重組蛋白表達，獲得一個大 小約為 17KDa 的重組蛋白，由于表達蛋白連接有 His 標簽，后期純化采用了鎳柱 純化的方法，獲得純化的重組蛋白 AGR2（貨號 RPC285Hu01），如圖 3 所示。

然后，用該蛋白免疫小鼠制備出小鼠抗人 AGR2 的單克隆抗體，并采用親和 層析的方法獲得高特異性的純化抗體（貨號 MAC285Hu21），同時免疫兔獲得兔抗 人 AGR2 的多克隆抗體（貨號 PAC285Hu01）。

獲得純化抗體后，通過 Western Blot 和 IHC 等方法對其質(zhì)量進行了一系列檢 測，結果如圖 4、5 所示。在 Western Blot 中，我們檢測了人結腸、小腸、胃組織 樣本，結果顯示為陽性，而大鼠肌肉組織樣本結果顯示為陰性，這樣就驗證了AGR2 表達的特異性。

此后，我們對純化的單克隆抗體（貨號 MAC285Hu21）進行了 FITC 標記， 獲得標記的抗人 AGR2 蛋白的抗體（貨號 MAC285Hu81），并用人胃癌組織進行 了 IHC 檢測，熒光顯微鏡下觀察結果如圖 6 顯示。結果顯示在人胃癌組織中有強 烈的熒光信號，且信號主要集中于胞漿中，從而證明了標記抗體的特異性和 FITC 標記的效率。

同時，在獲得蛋白和抗體后，Coud-Clone Corp.還研制出相應的 AGR2 蛋白定 量檢測試劑盒（貨號 SEC285Hu）。

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