Toll like receptor, Toll 樣受體，可識別外源性微生物，并引發(fā)一系列信號轉導， 促進炎性介質的釋放，啟動天然免疫反應。目前已發(fā)現(xiàn)的 TLRs 家族成員共有 10 多個，其中 TLR2 是目前已克隆人類 TLRs 家族中表達范圍最廣，識別病原微生物 及產物種類最多的分子，廣泛的分布于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細 胞及上皮細胞和腫瘤細胞中。鑒于 TLR2 在天然免疫中的重要作用，深入研究該蛋 白具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。Cloud-Clone Corp. 公司針對該蛋白研制出了 重組蛋白、抗體和 ELISA 檢測試劑盒等一系列檢測工具，供廣大研究者使用。

通過蛋白結構分析得知，TLR2 為 I 型跨膜蛋白，其序列分為胞外段、跨膜段 和胞內段。由于 TLR2 胞外區(qū)含有 19 個 LRR 重復區(qū)域，通過抗原表位分析、蛋白 結構預測，以及蛋白可溶性分析后，選定 Pro47-Gly245 片段作為表達的 TLR2 重 組蛋白。該片段為胞外片段，方便有需要的研究者對該蛋白進行研究。根據(jù) NCBI 中 NM_003264.3 的 CDS（編碼 TLR 的核酸序列）設計引物，由于序列中有 EcoRI 酶切位點，在上下游引物中分別含有一個 BamHI 和一個 Xhol 的酶切位點，用于后 期重組載體的構建：

[PRIMER INFORMATION]

Upstream Primer:CGCggatccGAATCCTCCAATCAGGCTTCTCTG

Downsream Primer: CCGctcgagTCACAGTGCTGTCCTGTGACATTCCGAC

完成引物設計后，利用 PCR 技術獲得片段為 600bp 的 DNA 片段。測序正確后， 采用傳統(tǒng)的雙酶切將擴增片段與 Cloud-Clone Corp.自主構建的大腸桿菌表達載體 pUSCNK-1 進行連接，完成表達質粒的構建，測序結果如圖 1 所示。

1 CCCTCAGGGCTCACAGAAGCTGTAAAAAGCCTTGACCTGTCCAACAACAGGATCACCTAC

61 ATTAGCAACAGTGACCTACAGAGGTGTGTGAACCTCCAGGCTCTGGTGCTGACATCCAAT

121 GGAATTAACACAATAGAGGAAGATTCTTTTTCTTCCCTGGGCAGTCTTGAACATTTAGAC

181 TTATCCTATAATTACTTATCTAATTTATCGTCTTCCTGGTTCAAGCCCCTTTCTTCTTTA

241 ACATTCTTAAACTTACTGGGAAATCCTTACAAAACCCTAGGGGAAACATCTCTTTTTTCT

301 CATCTCACAAAATTGCAAATCCTGAGAGTGGGAAATATGGACACCTTCACTAAGATTCAA

361 AGAAAAGATTTTGCTGGACTTACCTTCCTTGAGGAACTTGAGATTGATGCTTCAGATCTA

421 CAGAGCTATGAGCCAAAAAGTTTGAAGTCAATTCAGAATGTAAGTCATCTGATCCTTCAT

481 ATGAAGCAGCATATTTTACTGCTGGAGATTTTTGTAGATGTTACAAGTTCCGTGGAATGT

541 TTGGAACTGCGAGATACTGATTTGGACACTTTCCATTTTTCAGAACTATCCACTGGTTGA

圖1 pUSCNK-1 hTLR2測序結果

將該序列與NCBI中TLR2的基因序列進行對比，相似性為100%。進一步證明 擴增序列的正確性。序列對比結果如圖2

圖2 核酸序列對比結果

之后，通過 IPTG 誘導重組蛋白體外表達，獲得一個大小約 29KD 的重組蛋白， 基于表達獲得的重組蛋白有 His 標簽，后期純化采用鎳柱純化，獲得高純度的重組 蛋白 TLR2(貨號 RPA663Hu01)，蛋白序列信息如圖 3 所示，該蛋白的凝膠電泳圖 如圖 4 所示。

MGHHHHHHSGSEF- PSGL TEAVKSLDLS NNRITYISNS DLQRCVNLQA LVLTSNGINT IEEDSFSSLG SLEHLDLSYN YLSNLSSSWF KPLSSLTFLN LLGNPYKTLG ETSLFSHLTK LQILRVGNMD TFTKIQRKDF AGLTFLEELE IDASDLQSYE PKSLKSIQNV SHLILHMKQH ILLLEIFVDV TSSVECLELR DTDLDTFHFS ELSTG

圖 3 蛋白序列信息

用純化得到的重組蛋白，通過 SDS-PAGE（純度>95%）免疫小鼠，獲得小鼠 抗人 TLR2 的單克隆抗體，并采用親和層析法獲得高特異性的純化抗體（貨號 MAA663Hu21）， 免疫家兔制備兔抗人 TLR2 的多克隆抗體（貨號 PAA663Hu01）。

獲得純化抗體后，通過 Western Blot 對其質量進行了一系列檢驗，結果如圖 5 所示。

同時，我們還用人脾臟組織對 純化的抗體進行了 IHC 驗證（如圖 6），結果顯示在人脾臟組織中有 強陽性信號，且主要集中于細胞膜 上。以上實驗進一步證明了抗人 TLR2 抗體的高特異性。

 Cloud-Clone Corp.還用獲得的 高純度蛋白以及高特異性的抗體 作 為 原 料 ， 自 主 研 制 出 圖 6 IHC-P 檢測結果 人 TLR2 蛋白定量檢測試劑盒（貨 號 SEA663Hu）。

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