眾所周知，對于具有多個表位的抗原而言，雙夾心 ELISA（Double Sandwich ELISA）可應(yīng)用于目標抗原或抗體的定量檢測。而對于小分子抗原或半抗原，因缺 乏可作夾心法的兩個以上的結(jié)合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定。此時， 可以采用競爭抑制法模式來檢測其中靶分子的含量。競爭抑制 ELISA 又叫封閉 ELISA，其主要原理是將標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。 標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺，也就 是說，最終顯色的結(jié)果與待檢抗原或抗體的干擾程度成負相關(guān)。小分子激素、藥物 等 ELISA 測定多用此法。

對于很多習(xí)慣了雙夾心法ELISA檢測的實驗人員而言，在面對競爭抑制ELISA 數(shù)據(jù)時常常會遇到不知如何分析的問題，上次我們已就經(jīng)典的雙夾心 ELISA 標準 曲線的繪制和擬合進行了詳細講解（雙夾心法標準曲線的擬合方法），因此，接下 來我們將以 Cloud. Clone 公司的 CEA924Ge，氰鈷胺素(CNCbl)檢測試劑盒的一次 質(zhì)檢標準品吸光度值為例，詳細地介紹一下用 EXCEL 軟件進行競爭抑制 ELISA 標 準曲線的擬合步驟。

如圖 1 所示，實驗人員從最高 10000 pg/mL 濃度的標準品（第 F1 孔），經(jīng)倍 比稀釋至 123.5 pg/mL 濃度（第 B1 孔），陰性對照孔為單獨的標準品稀釋液（第 A1 孔），可以看出對于競爭抑制 ELISA 法來說，一般而言陰性對照孔的吸光度值 最大。

與雙夾心法 ELISA 不同的是，競爭抑制 ELISA 的標準品吸光度值并不需要減 去陰性對照孔的本底吸光度值。以標準品的各孔吸光度值為 x 軸，標準品相應(yīng)濃度 取 Log10 后的值(如圖 2 所示的綠色突出顯示部分)為 y 軸作 XY 散點圖，得到一條 5 點曲線，其中 X 軸為吸光度（Optical Density），Y 軸為濃度的對數(shù)值（Log. of Concentration），如圖 3 所示。

接著，在該曲線中任選一點以右鍵打開，選擇”添加趨勢線(R)”，圖表上便 會彈出一個對話框。在“類型”選項中選擇“多項式(P)”并將“階數(shù)(P)”設(shè)定為 2 階。最后，在“選項”中勾選“顯示公式(E)”和“顯示 R 平方值(R)”（如圖 4 及圖 5 所示），點確定，便會出現(xiàn)標準曲線的對應(yīng)公式及 R2 值（如圖 6 所示）。

圖 3 標準曲線示例圖

圖 4. 添加擬合公式的過程示意圖

圖 5 典型帶擬合公式的標準曲線示意圖

 在了解了競爭抑制 ELISA 標準曲線的繪制方法之后，我們?nèi)绾闻袛嘁粭l標準 曲線是否良好呢？一般而言，合格的競爭抑制 ELISA 標準曲線應(yīng)具備以下三點：

1. 標準品濃度越高，則得到的吸光度值越低，即樣品中分析物濃度與吸光度 呈負相關(guān)；

2. R2值應(yīng)至少大于 0.95，并且越接近 1 越好；

3. 陰性對照孔的吸光度值應(yīng)大于 0.8。

接下來，我們將繪制和分析競爭抑制 ELISA 標準曲線過程中常見的問題及相 應(yīng)的解決方案總結(jié)如下：

表 1. 競爭抑制 ELISA 標準曲線的常見問題及解決方案