免疫組織化學(xué)用于觀察標(biāo)本的染色結(jié)果對(duì)靶抗原抗體進(jìn)行鑒定和定位，其標(biāo)本制備非常重要。在制作標(biāo)本過程中，需保持抗原的完整性，在染色、洗滌包埋等過程中避免發(fā)生溶解和變性，同時(shí)防止擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中。

圖1. IHC結(jié)果示意圖

組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學(xué)結(jié)果的前提，活體組織，各種體液及穿刺液和細(xì)胞都可以用于免疫組化分析，針對(duì)不同的標(biāo)本類型可以選擇不同的制備方法?；铙w組織常選用石蠟切片和冰凍切片處理，而體液、穿刺液及細(xì)胞樣本則選用涂片方式處理。對(duì)于細(xì)菌菌落或尸體病變組織，可將新鮮切面壓印于玻片上做成印片。我們首先介紹活體組織樣本常用的組織學(xué)制片技術(shù)，冰凍切片和石蠟切片。

一 冰凍切片

1、操作方法及步驟

①取材，取新鮮組織，切成小塊，厚度為2mm。

②速凍， 將組織塊平放于潔凈的小盒內(nèi)， 加入OCT包埋劑浸泡組織后，入液氮速凍大約10-20s迅速冰凍成塊，如需保存，應(yīng)置于-80℃存儲(chǔ)備用。

③固定， 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。

④切片， 將冷凍切片機(jī)置于低溫密閉室內(nèi)，連續(xù)切薄片5～10um。切片的厚度根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切。不同組織也許調(diào)整選擇不同冷凍度。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15～-20℃左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30℃。

適用樣本：不穩(wěn)定的抗原

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，組織的抗原性保存好，適用于不穩(wěn)定的抗原。

缺點(diǎn)：組織結(jié)構(gòu)欠清晰；

二 石蠟切片

1、操作方法及步驟

①取材，選擇所需要的觀察的部位，切成小塊2-3mm厚。

②固定，用生理鹽水清洗肝組織，浸泡于中性福爾馬林固定液中固定30-50min。

③脫水，將組織放置于梯度濃度的酒精中脫水。

50%酒精(0.5h)  ————> 70%酒精(0.5h) ————> 80%酒精(0.5h) ————>  95%酒精(0.5h) ————> 100%酒精(0.5h) ————> 100%酒精(0.5h)

④透明，脫水后，將組織浸泡三級(jí)透明液，處理后，組織塊顯現(xiàn)透明狀態(tài)。

1/2二甲苯+1/2無水乙醇(2h) ————> 純二甲苯(1.5h) ————> 純二甲苯(1.5h)

⑤浸蠟，透明處理后，將組織置于1/2二甲苯+1/2無水乙醇溶液中，40℃恒溫箱放置40分鐘，放入石蠟I 30min,石蠟II40min以除去組織中的透明劑。浸蠟需在恒溫箱中進(jìn)行，時(shí)間根據(jù)組織大小而定。

⑥包埋，調(diào)節(jié)恒溫箱溫度至60℃，換純蠟3次，每次1-2h,

⑦切片,將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)上，切片厚度為4-10um.完成后，可置于纖維鏡下觀察切片是否良好。

⑧粘片，在潔凈的載玻片上涂上粘片劑，后滴加載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，將組織切片粘上去，將載玻片置于35℃燙板上，傾斜或用吸水紙除去水分后，在燙板上晾干。

2、優(yōu)點(diǎn)：組織細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)清楚。

3、缺點(diǎn)：對(duì)抗原的保存量不如冷凍切片。