應(yīng)用重組DNA將目標基因進行表達得到的蛋白質(zhì)成為重組蛋白，重組蛋白在生物信號傳導(dǎo)過程，藥物研發(fā)，科學(xué)研究中扮演著重要角色。下面來介紹一下重組蛋白的生產(chǎn)工藝流程。

1.基因擴增

（1）引物合成

搜索目標蛋白基因信息，結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)信息，選取片段或全長設(shè)計引物。注意避開跨膜區(qū)，以及復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，優(yōu)選N端或C端，引物評分盡可能高，并搜索出核酸序列的酶切位點，使用載體等信息。經(jīng)研發(fā)部根據(jù)研發(fā)經(jīng)驗提出修改意見最終定稿后交由第三方公司進行引物合成。

（2）基因克隆機重組鑒定

1）PCR

根據(jù)目的蛋白特異性表達組織，選取特異組織RNA用上述引物進行PCR擴增。進行瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量大小選取目標片段進行切膠回收。再次PCR擴增，獲得大量DNA，并進行PCR產(chǎn)物回收。

2）酶切，連接

根據(jù)酶切位點，將目標PCR產(chǎn)物以及相應(yīng)載體進行酶切，獲得粘性末端的DNA產(chǎn)物后，進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目標條帶大小選取相應(yīng)片段切膠回收。并將具有相同酶切位點的載體與DNA片段進行連接

3）轉(zhuǎn)化，挑菌驗證

將連接好的目的片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli,并在LB平板上進行過夜培養(yǎng)。挑取平板上的菌斑進行驗證PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目標條帶大小選取相應(yīng)菌液進行測序，測序正確后留種保存。

2.蛋白表達

（1）蛋白表達小試

挑取少量菌種進行培養(yǎng)，并誘導(dǎo)表達，將表達的蛋白進行SDS-PAGE，根據(jù)目標條帶大小判斷目標蛋白是否表達，小試表達成功后將進行蛋白預(yù)放大實驗

（2）蛋白放大實驗

將小試表達成功的蛋白菌株用400-800 ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)表達，進行SDS-PAGE，根據(jù)目標條帶大小判斷目標蛋白是否表達成功，預(yù)放大實驗成功后將進行進一步的蛋白放大實驗，放大實驗使用800-1600 ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，具體驗證同上。

3.蛋白純化

由于載體中包含了his標簽，故采用鎳柱進行純化。有些蛋白可能會形成包涵體，在之前的一篇專題中我們有詳細介紹過大腸桿菌重組蛋白純化方法,純化后的蛋白會進行SDS-PAGE， BCA等實驗分子量以及純度進行驗證，純度超過95%。

4. 質(zhì)量檢測

獲得蛋白后會進行凍干，凍干之后會進行常規(guī)蛋白實驗進行驗證，合格后保存。

重組蛋白的制備主要是依據(jù)以上原理及步驟。以上是以原核表達舉例。在制備過程中每一個環(huán)節(jié)都至關(guān)重要，不同的蛋白會在不同的環(huán)節(jié)出現(xiàn)技術(shù)難點，包括目的基因的擴增，包涵體的形成都會對重組蛋白的研發(fā)造成困境。但Cloud Clone Corp. 具有多年研發(fā)經(jīng)驗，還可提供真核表達系統(tǒng)，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，用戶可根據(jù)需要選擇，同時對蛋白有特殊要求我們也可提供私人定制。

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