在Western Blot（WB）的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，總會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題：沒(méi)有條帶，雜帶多，轉(zhuǎn)膜不成功，曝光時(shí)間把握不好……不要著急，根據(jù)多年的WB經(jīng)驗(yàn)，我們總結(jié)了以下WB實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)各種突發(fā)狀況的分析和處理方法：

1. SDS-PAGE出現(xiàn)異常條帶

1）微笑現(xiàn)象

處理方法：可能是由于凝膠的中間部分凝固不均導(dǎo)致，待其充分凝固后再做實(shí)驗(yàn)。

2）拖尾現(xiàn)象

處理方法：可能是由于樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起。建議：加樣前離心；加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。

3）條帶粗

處理方法：可能是由于濃縮膠未濃縮好。建議：增加濃縮膠長(zhǎng)度；保證濃縮膠的pH正確（6.7）；降低電壓。

4）紋理現(xiàn)象

處理方法：可能是由于樣本中不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

2. 轉(zhuǎn)膜條件及膜的選擇

下圖為不同轉(zhuǎn)膜方法的轉(zhuǎn)膜效率：

可以觀察到轉(zhuǎn)膜效率：濕轉(zhuǎn)過(guò)夜>濕轉(zhuǎn)3小時(shí)>半干轉(zhuǎn)1小時(shí)。

在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，靶蛋白分子量小轉(zhuǎn)印時(shí)間縮短，分子量大則適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間。并建議優(yōu)先選擇聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜，相對(duì)硝酸纖維素（NC）膜機(jī)械強(qiáng)度高，和蛋白結(jié)合牢。

3. 條帶出現(xiàn)降解或斷裂帶

lane 13：心臟組織震動(dòng)溶解2h；lane 14：心臟組織短時(shí)超聲；lane 15：心臟組織超聲10min

處理方法：樣本制備過(guò)程中盡量保持低溫，避免蛋白變性、降解、斷裂，對(duì)于胃腸胰等蛋白酶含量高的樣本建議添加蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑建議新鮮配制。

4. 曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短出現(xiàn)非特異性帶或條帶消失

處理方法：建議選不同時(shí)間點(diǎn)多曝光幾次。

5. 條帶不整齊

處理方法：可能是由于膠凝固不均勻，建議待膠完全凝固后上樣；可能是由于電泳的時(shí)候，有氣泡在膠的下邊緣，建議電泳前，檢查并趕走膠底部的氣泡；可能是由于上樣buffer不是工作液濃度，建議重新配置上樣buffer；可能是由于拔梳子導(dǎo)致樣品孔不齊，建議水平緩慢的拔梳子。

6. 無(wú)條帶

處理方法：可能是轉(zhuǎn)膜失敗，可以通過(guò)立春紅染色檢驗(yàn)；可能是一抗二抗用錯(cuò)或濃度不合適，可設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照或重新調(diào)整抗體濃度；ECL發(fā)光底物失效，可換用新的發(fā)光底物。

WB的實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)較長(zhǎng)，每個(gè)步驟都會(huì)對(duì)最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)對(duì)照、實(shí)驗(yàn)記錄，步步監(jiān)測(cè)，方便查找原因。