NGF活性蛋白誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理：

神經(jīng)生產(chǎn)因子（Nerve growth factor, NGF）是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)肽，主要參與某些神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、維持、再生長(zhǎng)和分化作用。PC12細(xì)胞株來(lái)源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，該細(xì)胞對(duì)NGF有可逆的神經(jīng)元顯形反應(yīng)，當(dāng)PC12細(xì)胞暴露在NGF，細(xì)胞會(huì)在一周之內(nèi)作出反應(yīng)，主要是停止細(xì)胞分裂并延伸神經(jīng)突。

實(shí)驗(yàn)方案：

PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清和10%馬血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，換用含有10ng/ml NGF重組蛋白的新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞的形態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

A. PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清和10%馬血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中，10ng/ml NGF重組蛋白刺激6天后的細(xì)胞形態(tài)；

B. PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含5%胎牛血清和10%馬血清的Ham's F12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后的細(xì)胞形態(tài)。

結(jié)果分析：

云克隆重組NGF活性蛋白與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)轭?lèi)似于交感神經(jīng)元的形態(tài)，突起逐漸增多并延長(zhǎng)。

NGF活性蛋白與a2M的結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案：

α2-巨球蛋白（Alpha-2-Macroglobulin, a2M）是NGF的一個(gè)作用因子，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)a2M與NGF的相互作用。

1. 重組NGF蛋白用PBS，含 0.01% BSA（pH 7.4）稀釋成不同的濃度；

2. 取100μL加入到包被有人重組a2M的微孔板中，37℃條件下孵育2h；

3. 用PBST洗板，以anti-NGF多克隆抗體孵育1h，洗板3次；

4. 以HRP標(biāo)記的二抗孵育，洗板3次；

5. 加入底物溶液，37℃孵育15-25min；

6. 加入終止液并在450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果分析：

云克隆重組NGF活性蛋白與a2M有結(jié)合活性，結(jié)果顯示呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。

參考信息：

云克隆NGF活性蛋白貨號(hào)：APA105Hu01