肝臟自噬：代謝穩(wěn)態(tài)與疾病治療的潛在關(guān)鍵
肝臟是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的代謝器官，在血漿蛋白合成、糖異生和糖原儲(chǔ)存、膽固醇代謝和膽汁酸合成以及藥物代謝和解毒中起關(guān)鍵作用。過(guò)去幾十年的研究表明，自噬是由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞分解代謝過(guò)程，在維持肝臟中的細(xì)胞和代謝穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。肝臟自噬隨激素信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性而波動(dòng)，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)進(jìn)食和禁食狀態(tài)以及晝夜節(jié)律活動(dòng)有反應(yīng)。肝實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的自噬功能障礙可導(dǎo)致各種肝臟疾病，包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)、酒精相關(guān)肝病、藥物性肝損傷、膽汁淤積、病毒性肝炎和肝細(xì)胞癌。因此，靶向自噬可能是治療這些不同肝臟疾病的潛在策略。
1. 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征通過(guò)選擇性自噬介導(dǎo)的Eepd1降解加劇NASH進(jìn)展
以慢性間歇性缺氧(CIH)為特征的阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是加重非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科Junli Liu團(tuán)隊(duì)對(duì)CIH暴露和常氧暴露的小鼠進(jìn)行了配對(duì)喂養(yǎng)研究[1]。研究表明，CIH暴露會(huì)加重DNA損傷，導(dǎo)致肝纖維化和炎癥。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)數(shù)據(jù)分析還揭示了DNA修復(fù)酶Eepd1與OSAS之間的關(guān)聯(lián)。此外，研究發(fā)現(xiàn)CIH觸發(fā)選擇性自噬，導(dǎo)致Eepd1自噬降解，從而加劇肝細(xì)胞中的DNA損傷(圖1)。值得注意的是，Eepd1肝臟特異性敲除小鼠表現(xiàn)出加重的肝臟DNA損傷和NASH的進(jìn)一步進(jìn)展。為了確定CIH誘導(dǎo)的NASH的治療方法，進(jìn)行了藥物篩選，發(fā)現(xiàn)瑞替加濱抑制CIH介導(dǎo)的Eepd1降解，從而減輕肝細(xì)胞中的DNA損傷。這些發(fā)現(xiàn)意味著靶向CIH介導(dǎo)的Eepd1降解可以成為治療因OSAS而加劇的NASH的輔助方法。
圖1 CIH在體內(nèi)和體外通過(guò)Hif1α促進(jìn)自噬
2. NDP52通過(guò)Rab9依賴(lài)性溶酶體降解途徑介導(dǎo)對(duì)乙型肝炎病毒感染的抗病毒反應(yīng)
自噬受體NDP52觸發(fā)細(xì)菌對(duì)感染的自噬。然而，NDP52預(yù)防病毒感染的能力尚未確定。上海中國(guó)科學(xué)院Yu Wei團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)NDP52與乙型肝炎病毒(HBV)的包膜蛋白結(jié)合，并引發(fā)促進(jìn)HBV清除的降解過(guò)程[2]。肝細(xì)胞中NDP52的失活導(dǎo)致溶酶體中病毒包膜的靶向性降低，病毒復(fù)制水平升高。NDP52在病毒進(jìn)入和復(fù)制后期都能抑制HBV。與NDP52介導(dǎo)的細(xì)菌自噬相反，HBV包膜的溶酶體降解與GAL8和ATG5無(wú)關(guān)。NDP52與Rab9和病毒包膜蛋白形成復(fù)合物，并將HBV與Rab9依賴(lài)的溶酶體降解途徑聯(lián)系起來(lái)(圖2)。這些發(fā)現(xiàn)表明，NDP52作為HBV感染的傳感器，介導(dǎo)了一種獨(dú)特的抗病毒反應(yīng)來(lái)消除病毒。
圖2 Rab9參與NDP52介導(dǎo)的病毒降解
3. CHIP通過(guò)促進(jìn)K63和k27相關(guān)的STX17泛素化促進(jìn)自噬體-溶酶體融合改善NAFLD
自噬體和溶酶體的融合對(duì)于預(yù)防NAFLD至關(guān)重要。韓國(guó)延世大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)系Jaewhan Song團(tuán)隊(duì)建立了一種肝細(xì)胞特異性CHIP敲除(H-KO)小鼠模型，該模型在高脂肪飲食(HFD)或高脂肪、高果糖飲食(HFHFD)的反應(yīng)下更快地發(fā)展為NAFLD[3]。H-KO小鼠和CHIP耗竭細(xì)胞肝臟中P62和LC3的積累表明自噬體-溶酶體融合受到抑制。AAV8介導(dǎo)的小鼠肝臟中CHIP的過(guò)表達(dá)減緩了HFD或HFHFD喂養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD的進(jìn)展(圖3)。從機(jī)制上講，CHIP誘導(dǎo)STX17賴(lài)氨酸198殘基的K63和K27連接的多泛素化，導(dǎo)致STX17-SNAP29-VAMP8復(fù)合物形成增加。STX17 K198R突變體未被CHIP泛素化；它干擾了其與VAMP8的相互作用，使STX17無(wú)法抑制小鼠脂肪變性的發(fā)展。這些結(jié)果表明，涉及CHIP介導(dǎo)的STX17非降解泛素化的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于自噬體-溶酶體融合是必要的。
圖3 AAV8介導(dǎo)的肝臟CHIP過(guò)表達(dá)抑制HFD或HFHFD引起的NAFLD進(jìn)展
云克隆不僅可提供多種肝臟疾病動(dòng)物模型，包括肝纖維化、肝缺血、酒精性肝病、肝內(nèi)膽汁淤積、肝硬化、脂肪肝、肝功能衰竭等，涵蓋常見(jiàn)肝臟疾病。還具有還具有多個(gè)物種肝星形細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、肝間充質(zhì)干細(xì)胞等原代細(xì)胞產(chǎn)品和肝臟疾病常用檢測(cè)指標(biāo)及上述Hif1α、GAL8、ATG5等相關(guān)產(chǎn)品，可助力廣大科研工作者進(jìn)行肝臟疾病與自噬研究。
肝纖維化(HF)小鼠模型
建模方法：
按5ml/kg體重皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20%CCl4的油劑溶液（CCl4：橄欖油 =1:4）, 每3天1次，連續(xù)6周。對(duì)照組動(dòng)物皮下注射等量等次的橄欖油溶劑。正常飲食飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物活動(dòng)、精神狀況和飲食量 , 實(shí)驗(yàn)前后稱(chēng)量小鼠體重。
完成持續(xù)給藥6周后，稱(chēng)體重，麻醉小鼠，摘眼球取血，室溫靜置2h后于4℃， 3000r離心10分鐘提取血清，放入-80℃冰箱凍存。同時(shí)取肝左葉組織 1.5cm×1cm×0.2cm 于 10% 中性福爾馬林中固定，石蠟包埋；其余肝組織液氮或者-80℃冷凍保存。
肝缺血(HI)小鼠模型
建模方法：
1. 小鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水。
2. 麻醉小鼠，麻醉成功后將小鼠平躺在手術(shù)臺(tái)上膠帶固定四肢，將小鼠腹部術(shù)去毛，用碘酒和75％乙醇術(shù)區(qū)消毒。
3. 取腹正中切口 1cm，打開(kāi)腹腔，小心分離出肝臟供血的門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈。
4. 用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，0.5min 后，肉眼可見(jiàn)阻斷葉明顯變白，說(shuō)明阻斷成功，用止血鉗夾閉皮膚切口臨時(shí)關(guān)閉腹腔，同時(shí)將小鼠放在37℃恒溫加熱墊上保溫。
5. 完成持續(xù)缺血60min后，重新打開(kāi)腹腔，迅速取出血管夾，恢復(fù)缺血肝血流，0.5min左右可見(jiàn)缺血區(qū)肝臟由白色逐漸恢復(fù)為鮮紅色表明再灌注成功，逐層縫合腹腔肌肉和皮膚關(guān)閉腹腔，完成手術(shù)。待小鼠清醒后放回飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，密切關(guān)注小鼠的狀態(tài)及生存狀況并做好記錄。
參考文獻(xiàn)
[1]Xiong J, Xu Y, Wang N, et al. Obstructive Sleep Apnea Syndrome Exacerbates NASH Progression via Selective Autophagy-Mediated Eepd1 Degradation. Adv Sci (Weinh). 2024;11(35):e2405955. (IF=14.3)
[2]Cui S, Xia T, Zhao J, et al. NDP52 mediates an antiviral response to hepatitis B virus infection through Rab9-dependent lysosomal degradation pathway. Nat Commun. 2023;14(1):8440. (IF=14.7)
[3]Rho H, Kim S, Kim SU, et al. CHIP ameliorates nonalcoholic fatty liver disease via promoting K63- and K27-linked STX17 ubiquitination to facilitate autophagosome-lysosome fusion. Nat Commun. 2024;15(1):8519. (IF=14.7)